2024年7月10日，《Cancer Cell》在線發(fā)表Mar醫(yī)院研究所Toni Celià-Terrassa團(tuán)隊(duì)的突破性成果。研究揭示，TIM3?乳腺癌細(xì)胞在微轉(zhuǎn)移“爆發(fā)窗口”中扮演免疫逃逸主控角色：于免疫健全宿主內(nèi)，TIM3在定植初期即被選擇性上調(diào)，驅(qū)動細(xì)胞獲得增強(qiáng)的干性、生存力與免疫隱身能力，從而成為轉(zhuǎn)移級聯(lián)的核心引擎。

背景：

轉(zhuǎn)移性乳腺癌仍無根治手段，每年導(dǎo)致近70萬人死亡。現(xiàn)行輔助/新輔助治療旨在清除微轉(zhuǎn)移灶，卻受限于其免疫機(jī)制不明：多數(shù)播散細(xì)胞死于遠(yuǎn)端脅迫，僅少數(shù)具備干性與EMT特征的MICs存活并逃逸免疫。肝臟耐受性微環(huán)境更使轉(zhuǎn)移灶對免疫治療遲鈍。免疫檢查點(diǎn)TIM3本以T細(xì)胞耗竭而聞名，新近發(fā)現(xiàn)亦高表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞，激活AKT/β-catenin信號，卻未知其在微轉(zhuǎn)移中的角色。本研究證實(shí)，TIM3在乳腺癌細(xì)胞富集預(yù)示預(yù)后不良，并直接賦予MICs存活、干性與免疫逃逸能力，為阻斷微轉(zhuǎn)移提供潛在新靶。

結(jié)論1： 建模實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移免疫編輯

以未免疫編輯的EpRas乳腺癌細(xì)胞構(gòu)建全身轉(zhuǎn)移模型，比較免疫缺陷與免疫健全小鼠。生物發(fā)光顯示健全鼠轉(zhuǎn)移顯著受抑；RNA-seq及聚類證實(shí)免疫選擇主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄差異，富集免疫抑制、EMT和干性通路，TIM3在腫瘤細(xì)胞普遍上調(diào)，肝轉(zhuǎn)移尤甚。4T07模型進(jìn)一步驗(yàn)證免疫壓力下TIM3表達(dá)升高，提示其介導(dǎo)逃逸與干性的治療靶點(diǎn)。

Fig1. 轉(zhuǎn)移免疫壓力正向選擇 TIM3+ 轉(zhuǎn)移細(xì)胞

結(jié)論2： TIM3 在免疫壓力下促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移能力

以未免疫編輯的EpRas細(xì)胞建立全身轉(zhuǎn)移模型，比較免疫缺陷與免疫健全小鼠。健全鼠轉(zhuǎn)移受抑，RNA-seq顯示免疫選擇塑造轉(zhuǎn)錄譜，富集免疫抑制、EMT與干性；TIM3在腫瘤細(xì)胞普遍上調(diào)，肝轉(zhuǎn)移更甚。4T07模型證實(shí)免疫壓力下TIM3升高，提示其介導(dǎo)逃逸與干性的治療靶點(diǎn)。

Fig2. TIM3 驅(qū)動乳腺癌轉(zhuǎn)移

結(jié)論3：TIM3 與 EMT 樣細(xì)胞相關(guān)并激活 β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

用未免疫編輯的EpRas-FLuc-GFP低表達(dá)細(xì)胞，經(jīng)心腔注射建立乳腺癌全身轉(zhuǎn)移模型，對比NSG免疫缺陷與Balb/c免疫健全小鼠。BLI顯示健全鼠轉(zhuǎn)移負(fù)荷顯著降低；20天后分離肺、肝、腦灶，流式純化腫瘤細(xì)胞，RNA-seq無免疫細(xì)胞污染。PCA與聚類證實(shí)免疫選擇主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄差異；GO/GSEA示健全鼠來源細(xì)胞富集免疫抑制、干性及EMT通路。TIM3在腫瘤細(xì)胞普遍上調(diào)，肝轉(zhuǎn)移尤甚。高表達(dá)TIM3的4T07模型進(jìn)一步驗(yàn)證免疫壓力下TIM3升高，提示其介導(dǎo)逃逸與干性的可靶機(jī)制。

Fig3. TIM3 MIC 顯示干性/EMT 樣特征和 β-catenin 激活

結(jié)論4： TIM3 腫瘤細(xì)胞在微轉(zhuǎn)移中的時(shí)空分析

為捕捉TIM3?細(xì)胞早期定植，4T07-FLuc-GFP經(jīng)心腔注射后0、6 h及3 d BLI示6 h已分布多器官，肝切片證實(shí)DTC存在；3 d后免疫健全鼠信號驟降，表明多數(shù)DTC早期即被清除。繼而構(gòu)建Tim3-mCherry-Nluc雙報(bào)告系統(tǒng)，以流式及BLI實(shí)時(shí)追蹤Tim3啟動子活性，驗(yàn)證mCherry與TIM3蛋白高度一致。

Fig4. TIM3 轉(zhuǎn)移中的時(shí)空動力學(xué)

結(jié)論5：TIM3 MIC 重塑微轉(zhuǎn)移的免疫抑制免景觀

單細(xì)胞測序顯示，TIM3?微轉(zhuǎn)移灶內(nèi)免疫抑制細(xì)胞（IL-17?γδ T、Arg1?單核/中性粒）顯著增多，效應(yīng)CD8? T、DC及殺傷性中性粒減少；細(xì)胞互作增強(qiáng)抑制信號。光譜流式證實(shí)TIM3敲低可逆轉(zhuǎn)該抑制微環(huán)境，表明TIM3?腫瘤細(xì)胞通過重塑免疫格局實(shí)現(xiàn)早期免疫逃逸。

Fig5. TIM3 MIC 在微轉(zhuǎn)移過程中誘導(dǎo)免疫抑制環(huán)境

結(jié)論6：γδT細(xì)胞在肝微轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用

scRNA-seq分析4T07對照與Tim3敲低小鼠的肝微轉(zhuǎn)移、巨轉(zhuǎn)移及鄰近組織CD45?免疫細(xì)胞，鑒定27群并發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移期變化最顯著：TIM3?灶內(nèi)IL-17?γδ T、Arg1?單核/中性粒等抑制細(xì)胞增多，CD69?Gzmb?CD8? T、DC及殺傷性中性粒減少；細(xì)胞互作增強(qiáng)抑制信號。光譜流式驗(yàn)證TIM3?微轉(zhuǎn)移灶IL-17?γδ T升高、CD8?活化下降。結(jié)論：TIM3? MICs在早期通過招募抑制細(xì)胞、削弱效應(yīng)T細(xì)胞，營造促瘤免疫微環(huán)境。

Fig6. TIM3介導(dǎo)的免疫抑制中γδ T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和IL-1β的

功能轉(zhuǎn)移評估

結(jié)論7：表達(dá) TIM3 的腫瘤細(xì)胞獨(dú)立預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后不佳

257例乳腺癌IHC顯示，腫瘤細(xì)胞TIM3高表達(dá)預(yù)示無病及總生存期縮短，且獨(dú)立于T細(xì)胞TIM3；TNBC及III期風(fēng)險(xiǎn)最高。門脈接種與切除模型中，抗TIM3顯著減少肝、肺早期轉(zhuǎn)移，不影響原發(fā)瘤；療效與TIM3敲低等同。結(jié)果支持TIM3作為復(fù)發(fā)高危標(biāo)志，并推薦II/III期（新）輔助抗TIM3臨床試驗(yàn)。

Fig7. TIM3阻斷治療乳腺癌轉(zhuǎn)移的臨床和臨床前評價(jià)

研究局限性

本研究受限于人體細(xì)胞無法在完整免疫體系中應(yīng)用，故采用同基因小鼠模型；熒光標(biāo)記雖具免疫原性，但未標(biāo)記細(xì)胞仍重現(xiàn)TIM3表型。實(shí)驗(yàn)涵蓋EpRas、4T1、4T07、66cl4及AT3五種BC模型，前二者用于全身轉(zhuǎn)移，后三者用于自發(fā)轉(zhuǎn)移；4T07與4T1均攜帶Trp53熱點(diǎn)突變，模擬高TIM3表達(dá)的人類TNBC。